Мне становилось ясно, что эти достижения генной инженерии делали мышей превосходными подопытными животными для выявления генов и белков, ответственных за размыв формы долговременной потенциации. Теперь можно было узнать, как эти гены и белки связаны с формированием пространственной памяти. Хотя мыши — сравнительно простые млекопитающие, их головной мозг анатомически похож на человеческий, а гиппокамп у них, как и у людей задействован в формировании памяти о местах и предметах. Кроме того, мыши размножаются намного быстрее, чем более крупные млекопитающие, такие как кошки, собаки, обезьяны и люди. Благодаря этому большие популяции мышей с одинаковыми генами, в том числе трансгенами или нокаутными генами, можно получать за несколько месяцев.
Новые, революционные экспериментальные методы имели серьезные последствия для биомедицинских исследований. Почти каждый ген человеческого генома представлен несколькими вариантами, так называемыми аллелями, которые по-разному распределены среди людей. Генетические исследования неврологических и психических расстройств человека позволили выявить некоторые аллели, ответственные за поведенческие различия между здоровыми людьми, а также аллели, лежащие в основе многих неврологических заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, раннее развитие болезни Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона и некоторые формы эпилепсии. Возможность вводить болезнетворные аллели в геном мыши и исследовать, какие нарушения они вызывают в мозгу и поведении, произвела революцию в неврологии.
Последней из причин, побудивших меня заняться исследованиями генетически модифицированных мышей, стал приход в нашу лабораторию нескольких талантливых постдоков, среди которых были Сет Грант и Марк Мейфорд. Грант и Мейфорд намного лучше меня разбирались в генетике мышей и сильно повлияли на направление наших исследований. Грант был инициатором начала работ с генетически модифицированными мышами, а критическое мышление Мейфорда сыграло важную роль впоследствии, когда мы начали совершенствовать методы, которые использовали для первого поколения экспериментов по генетике поведения мышей.
Первые использованные нами методы получения трансгенных мышей сказывались на всех без исключения клетках в организме мыши. Нам нужно было найти способ ограничить свои генетические манипуляции мозгом, а именно теми его участками, в которых формируются нейронные цепи, обеспечивающие работу эксплицитной памяти. Мейфорд разработал приемы, позволяющие ограничить экспрессию внедренных в геном мыши генов определенными участками мозга. Он также разработал метод, позволяющий управлять временем экспрессии генов в мозгу, включая и выключая их. Эти достижения начали очередной этап нашей работы и нашли широкое применение у других исследователей. Они остаются краеугольными камнями современных методов изучения поведения на генетически модифицированных мышах.
Первые попытки связать долговременную потенциацию с пространственной памятью были предприняты в конце восьмидесятых. Ричард Моррис, физиолог из Эдинбургского университета, показал, что, блокируя NMDA-рецепторы определенными препаратами, можно блокировать и долговременную потенциацию, тем самым мешая работе пространственной памяти. Мы с Грантом в Колумбийском университете и Сусуму Тонегава и его постдок Алсино Силва в Массачусетском технологическом институте независимо друг от друга сделали еще один важный шаг вперед в этом направлении. Нашим группам удалось получить генетически модифицированных мышей по одной линии, у которых отсутствовал важный белок, который, как считалось, задействован в долговременной потенциации. Затем мы исследовали, как изменилось поведение генетически модифицированных мышей по сравнению с нормальными мышами.
Мы проверяли способности этих мышей, наблюдая за тем, как они выполняют некоторые стандартные задания по ориентации в пространстве. Например, мы помещали мышь в центр большой, хорошо освещенной круглой площадки белого цвета, вдоль края которой расположены сорок отверстий. Только одно из этих отверстий вело в убежище. Площадка находилась в небольшом помещении, все стены которого были украшены непохожими друг на друга узорами. Мыши не любят открытое пространство, особенно хорошо освещенное. В таких условиях они чувствуют себя беззащитными и пытаются скрыться в убежище. Единственный способ бежать с этой платформы состоял в том, чтобы найти отверстие, ведущее в убежище. Рано или поздно мышь обучается находить это отверстие, запоминая пространственную связь между ним и узорами на стенах помещения.
Пытаясь скрыться, мышь использует одну за другой три стратегии: случайную, последовательную и пространственную. Любая из этих стратегий позволяет найти нужное отверстие, но они сильно отличаются друг от друга по эффективности. Вначале мышь суется в разные отверстия в случайном порядке и быстро обучается тому, что это неэффективная стратегия. Затем она начинает последовательно изучать отверстия одно за другим, пока не находит путь в убежище. Данная стратегия лучше, но и она не оптимальна. Обе эти стратегии не относятся к пространственным: для их использования мышам не требуется иметь внутреннюю карту пространственного устройства окружающей среды, записанную в мозгу (не требуется и участие гиппокампа). Наконец мышь начинает использовать пространственную стратегию, в которой задействован гиппокамп. Она запоминает, на какую стену смотрит искомое отверстие, и направляется к нему по прямой, ориентируясь по узорам на стенах. Большинство мышей быстро проходит первые две стратегии и вскоре обучается использовать пространственную.
Затем мы сосредоточились на изучении долговременной потенциации в одном проводящем пути гиппокампа — так называемых коллатералях Шаффера. Ларри Сквайр из Калифорнийского университета в Сан-Диего обнаружил, что повреждения этого пути вызывают нарушения памяти, похожие на те, которыми страдал Г. М. (пациент Бренды Милнер). Мы установили, что, нокаутируя определенный ген, который кодирует белок, играющий важную роль в долговременной потенциации, можно нарушить синаптическое усиление в коллатералях Шаффера. Кроме того, с этим генетическим нарушением у мышей было связано нарушение пространственной памяти.
Лаборатория в Колд-Спринг-Харбор каждый год проводит симпозиум, посвященный какой-то одной важной биологической теме. Темой симпозиума 1992 года была поверхность клеток, но, поскольку наши исследования и исследования Сусуму Тонегавы сочли достаточно интересными, ради нас решили устроить отдельную секцию, не связанную с поверхностью клеток, чтобы мы могли выступить на ее заседании. Мы с Тонегавой представили наши эксперименты, посвященные тому, как нокаутирование единственного гена подавляет и долговременную потенциацию в одном из проводящих путей гиппокампа, и пространственную память. Эти наблюдения были пределом того, что было известно не тот момент о связи долговременной потенциации с пространственной памятью. Вскоре после этого мы оба сделали еще один шаг вперед, изучив связь долговременной потенциации с пространственной картой окружающей среды, представленной в гиппокампе.
До этого симпозиума мы с Тонегавой были немного знакомы. В семидесятых годах ему удалось разобраться в генетических основах разнообразия антител. Это был выдающийся вклад в иммунологию, за который в 1987 году он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Оставив позади это достижение, он решил обратиться к нейробиологии и завоевывать новые научные миры. Он дружил с Ричардом Акселем, который и предложил ему встретиться со мной.