В 1987 году, когда Тонегава пришел ко мне, его особенно интересовала проблема сознания. Я старался поддержать его интерес к нейробиологии, но в то же время убедить отказаться от идеи изучать сознание, потому что для того времени эта область была слишком сложной и неопределенной, чтобы применять к ней молекулярный подход. Сусуму уже использовал генетически модифицированных мышей для изучения иммунной системы, поэтому намного более естественным и практичным выбором для него было обратиться к исследованию обучения и памяти, что он и сделал, когда в его лабораторию пришел Силва.
После 1992 года многие другие исследовательские группы тоже получили результаты, аналогичные нашим. Хотя связь между нарушениями долговременной потенциации и проблемами с пространственной памятью и не наблюдается в некоторых довольно важных случаях, тем не менее эта связь оказалась подходящим предметов исследования для изучения молекулярных механизмов долговременной потенциации и роли этих механизмов в работе памяти.
Мне было известно, что у мышей пространственная память, как и имплицитная память аплизий и дрозофил, состоит из двух компонентов: кратковременной памяти, которая не требует синтеза белков, и долговременной, которая требует его. Теперь мне хотелось выяснить, задействованы ли в формировании эксплицитной кратковременной и долговременной памяти особые синаптические и молекулярные механизмы. У аплизии формирование кратковременной памяти требует кратковременных синаптических изменений, вызываемых исключительно работой вторичных посредников. Для долговременной же требуются более устойчивые синаптические изменения, также основанные на изменениях в экспрессии генов.
Мы с коллегами исследовали срезы гиппокампа генетически модифицированных мышей и обнаружили, что в каждом из трех главных проводящих путей гиппокампа долговременная потенциация включает две фазы, похожие на фазы долговременного усиления связей у аплизии. Однократное воздействие серией электрических разрядов вызывает непродолжительную раннюю фазу долговременной потенциации, которая длится всего час, два или три и не требует синтеза новых белков. Реакция нейронов на подобную стимуляцию была именно такой, как ее описывал Роджер Николл: в постсинаптической мембране активировались NMDA-рецепторы, обеспечивая приток ионов кальция в постсинаптическую клетку. Кальций при этом действует как вторичный посредник, запуская долговременную потенциацию за счет усиления реакции AMPA-рецепторов на глутамат и стимуляции встраивания новых AMPA-рецепторов в постсинаптическую мембрану. Кроме того, в ответ на стимуляцию определенного характера постсинаптическая клетка может посылать сигнал в обратную сторону, в пресинаптическую клетку, чтобы та выделяла больше глутамата.
Многократное воздействие сериями электрических разрядов приводит к развитию поздней фазы долговременной потенциации, которая длится больше суток. Мы установили, что по своим свойствам эта фаза, которую детально еще никто не изучал, похожа на долговременное усиление синаптических связей у аплизии. В обоих случаях важную роль играют модуляторные интернейроны, которые у мышей служат для преобразования кратковременных гомосинаптических изменений в долговременные гетеросинаптические. У мышей эти нейроны выделяют дофамин — нейромедиатор, с помощью которого в мозгу млекопитающих работают механизмы внимания и подкрепления. Дофамин в гиппокампе мышей, подобно серотонину у аплизий, связывается с рецептором, который активирует фермент, повышающий концентрацию циклического АМФ. При этом существенно, что повышение концентрации циклического АМФ в гиппокампе мышей происходит в том числе и в постсинаптических клетках, в то время как у аплизии концентрация этого вещества повышается только в пресинаптических сенсорных нейронах. Циклический АМФ в обоих случаях активирует протеинкиназу А и другие протеинкиназы, что приводит к активации CREB-белка и включению структурных генов.
Одним из необычных открытий, сделанных нами ходе исследований памяти у аплизии, было обнаружение подавляющего работу памяти гена, кодирующего белок CREB-2. Подавление экспрессии этого гена у аплизии ускоряет увеличение силы синапсов и повышение их числа, связанные с долговременным усилением синаптических связей. Наши эксперименты на мышах показали, что у них подавление этого и других аналогичных генов, угнетающих работу памяти, усиливает долговременную потенциацию в гиппокампе и улучшает пространственную память.
В ходе этой работы у меня снова появилась приятная возможность сотрудничать со Стивеном Зигельбаумом. Нам нужно было разобраться с одним ионным каналом, подавляющим синаптическое усиление, особенно в некоторых дендритах. Мы с Олденом Спенсером уже исследовали эти дендриты в 1959 году и пришли к выводу, что потенциалы действия в них возникают в ответ на активацию перфорантного пути, ведущего из энторинальной коры в гиппокамп. Мы со Стивом вывели мышей, у которых не работал ген данного ионного канала. Оказалось, что у этих мышей долговременная потенциация в ответ на стимуляцию перфорантного пути существенно усилена, отчасти за счет дендритных потенциалов действия. В результате эти мыши отличались блестящими способностями: пространственная память у них была намного лучше, чем у нормальных мышей!
Кроме того, мы с коллегами выяснили, что для работы эксплицитной памяти в мозгу млекопитающих, в отличие от имплицитной у аплизий и дрозофил, требуется участие нескольких регуляторных генов в дополнение и генам CREB-белков. Хотя это требует уточнения, судя по всему, включение определенных генов у мышей тоже вызывает в анатомические изменения, а именно отрастание новых синаптических связей.
Несмотря на существенные поведенческие различия между имплицитной и эксплицитной памятью, некоторые механизмы работы имплицитной памяти, возникшие сотни миллионов лет назад у беспозвоночных, почти не изменились в ходе эволюции и легли в основу работы эксплицитной памяти в мозгу позвоночных. Хотя великий нейрофизиолог Джон Экклс и убеждал меня в начале моей научной карьеры не бросать исследования несравненного мозга млекопитающих ради работы с безмозглыми морскими слизнями, сегодня уже ясно, что существует целый ряд ключевых молекулярных механизмов работы памяти, общих для всех животных.
Изучение эксплицитной пространственной памяти у мышей не могло не привести меня к более общим вопросам, которые в самом начале моей научной карьеры стимулировали увлечение психоанализом. Я снова стал размышлять о природе внимания и сознания — явлений психики, связанных не с простыми рефлекторными действиями, а со сложными психологическими процессами. Мне хотелось сосредоточиться на том, как представлен в мышином мозгу образ пространства, то есть внутренняя картина окружающего, в котором мышь ориентируется, и как внимание видоизменяет этот образ. Мне нужно было оставить работу с уже неплохо изученной нервной системой аплизии и перейти к изучению систем мозга млекопитающих, которое пока приносило (а отчасти и по-прежнему приносит) лишь немного интереснейших результатов и множество неразрешенных вопросов. Тем не менее пришло время попытаться продвинуть молекулярную биологию когнитивных функций еще на один шаг вперед.